任何荧光应用都需要三种基本滤光片：(1) 激发滤光片，传输荧光团吸收波长的光；(2) 发射滤光片，传输荧光团发射波长的光；(3) 分束器，将激发光引导至样品，将发射光引导至检测器。
（图 1.包含硬质涂层的薄膜光学滤光片的荧光滤光片立方体。）
大多数激发和发射滤光片都是带通滤光片。这意味着它们传输特定波长或波长范围的光，同时阻挡两侧的相邻光谱。另一方面，分光镜是以一定角度设置的二向色或多向色滤光片。它们的工作原理是传输某些波长，同时反射其他波长。
2. 激发和发射滤光片应该注意的问题
带通滤光片是荧光系统的重要组成部分，因为它们可以最佳地针对每个荧光团或一组荧光团的激发和发射光谱（见图2）。带通滤波片的设计有两种根本不同的方法。第一个依赖于堆叠的法布里-珀罗谐振腔，而第二个结合了单独的长波通（LWP）和短波通（SWP）滤波器以形成带通的两个边缘。腔体滤波器的形状本质上是对称的，而 LWP 和 SWP 设计可以制成不对称的，这有助于在某些情况下降低成本。
（图 2.SYBR ® Green I DNA结合染色剂的激发和发射光谱与一组滤光片的透射光谱重叠，这些滤光片旨在优化该荧光团的检测和可视化。）
图 3显示了各种常见激发和发射滤光片波长和带宽的典型传输响应（或 %T）作为电磁频谱的函数。这些滤波器被完全阻挡，这意味着通带之外的所有波长都被拒绝，达到 OD6 或更高，以确保优化的信噪比。
（图 3.几种不同激发和发射带通滤波器的典型传输水平。能够在从紫外线到红外线波长的电磁光谱范围内实现高透射率。所有过滤器的阻塞水平均达到 OD6 或更高。）
尽管存在软涂层替代品，但硬涂层薄膜带通滤光片更耐用，并提供更高的带内传输，以及更陡峭的高带外 (OD) 阻挡过渡。所有这些因素都可以增强荧光系统的信噪比。这可以极大地改善激光扫描荧光共焦显微镜等应用的结果，其中信噪比决定了最终图像可实现的对比度。
信号的陡度也很重要，因为它可以实现通带中的高 %T 到高 OD 阻塞之间的更陡峭的过渡。滤波器形状越方形，带通（或边缘）滤波器的边缘越垂直。这在拉曼光谱中可能至关重要，例如，激光线滤光片需要具有陡峭的截止边缘来调制激光源。相反，激光阻挡滤光片（通常是拉曼长波通）需要具有陡峭的切边以完全阻挡来自激光的光。设计具有更陡峭斜率或改进方形度的带通滤波器是一个相对简单的问题，只需向滤波器添加更多空腔即可（见图4）。改善 LWP / SWP 设计的斜率大致相同，尽管在这种情况下添加了更多层。
（图 4.滤波器“方形度”是腔体滤波器中法布里-珀罗谐振腔数量或 LWP/SWP 设计中层数的直接函数。）
然而，添加空腔可能会给通带带来不良的纹波和损耗，从而导致最终图像的对比度降低。幸运的是，一种新颖的光学厚度监测方法可以增加腔数，同时保持低通带纹波。该系统的工作原理是连续测量过滤器功能并补偿与先前层相关的厚度误差。图 5展示了如何使用该技术对图 4中相同的高腔带通滤波器设计的四次涂层运行重复实现高传输率和低纹波。这种监控方法使滤波器能够满足高性能系统要求，而不会影响精度或准确度。
（图 5.高腔数过滤器的重复性。上图显示了来自三个不同腔室的四次完全阻塞的高腔数带通滤波器。）
2.3 通带外阻断
荧光检测滤光片的特征在于阻挡水平，特别是关于激发滤光片的重叠。对于大多数荧光应用，建议使用 5 至 6 OD 的带外阻断水平。然而，应特别考虑交叉点或激发响应下降和发射响应倾斜的波长范围。在大多数情况下，这些点的遮挡覆盖范围应该更大，因为该区域的遮挡不足可能会导致不希望的漏光。例如，如果发射滤光片不能充分阻挡更亮的激发光，它将压倒样本发射的较弱荧光，导致信噪比较差。
图6示出了图5所示带通滤波器的阻塞水平。该滤波器的所有带通层和阻挡层均位于基板的单面上，从而提高了传输率并降低了成本。基板背面的抗反射 (AR) 涂层可在名义上增加额外成本的情况下提高传输率。
图 6.图 5 中所示的高腔数带通滤波器的四次运行的阻塞水平的重复性。所有截止深度水平均达到 OD6。
最新的生物成像系统需要灵活的多波段照明以用于激发和发射。新一代薄膜硬涂层通过为多个通带提供高传输率和低纹波来满足此类要求苛刻的应用（见图7）。多频带滤波器通常根据传输频带和阻塞（抑制）频带来指定。
（图 7. EYFP 和 MitoTracker ® Red 的激发和发射光谱与为这些荧光团设计的双带滤光片组的透射光谱重叠。）
通带内的传输水平通常为 90-95%，而频段之间的平均阻塞水平范围为 5OD 至 6OD。通常，在多带滤波器中，通带和阻塞带之间的间隙为波长的 2-3%，尽管较窄的光谱间隙会增加成本。一般来说，可以通过避免陡峭的过渡斜率和 > 6OD 阻塞水平等规范来降低成本，除非系统需要这些规范。
二向色滤光片的功能是以最小的信号损失和最小的带间光谱间隙分离激发光和发射光的光谱带（见图8）。从反射到透射的急剧转变增强了许多应用的图像对比度，包括荧光和多光谱成像。为了在这些系统中实现，二向色滤光片必须具有低角度偏移、低偏振分裂以及反射和透射波前的出色平坦度，以消除任何明显的焦点偏移，这可能对任何成像系统不利。这对于全内反射荧光 (TIRF) 和结构照明显微镜等应用尤其重要。
（图 8.以 45 度角测量的二向色分束器的透射率。）
（图 9.四波段多色分束器的测量光谱与理论光谱的比较。传输水平是在 45 度角测量的。）
. 一般过滤器注意事项
4.1 涂层应力
涂层的沉积通常会在薄膜内产生应力，这通常会导致光学基材的平整度发生变化。应力的类型（拉伸或压缩）取决于所使用的涂层工艺的类型以及涂层条件的细节。通常，这种应力会导致基材轻微弯曲，形成山形或碗形。该曲率可以使用如图10和图11所示的光学干涉仪来测量。
（图 10 和 11.由于涂层应力而导致的基材弯曲。左图显示了使用干涉仪获得的测量相位，而右图是与参考平面相比的测量光程差。）
这种曲率对光束或图像的影响在某种程度上类似于透镜的影响，因此可能会给光学系统带来不必要的畸变。例如，当需要根据 CCD 检测器产生的图像测量含有荧光标记 DNA 的孔阵列的准确位置时，这可能变得很重要。只有将曲率的影响降至最低，才能进行准确的测量。
可以使用多种技术来抵消应力引起的曲率。幸运的是，最简单的解决办法可能只是增加基板的厚度，因为使用额外的技术会增加过滤器的成本。因此，保持可重复的应力（最好是低水平）对于保持高产量和低成本至关重要。
滤光片上厚度、平行度或折射率的任何变化也会导致失真，但仅限于透射光。这种类型的失真称为透射波前误差 (TWE)，也可以使用干涉仪来确定（见图12 和 13）。仪器设计的进步推动了 TWE 性能水平的提高，因此需要仔细管理与涂层相关的可测量的 TWE 量，以优化图像质量。
许多因素直接影响滤光片的成本，特别是在大批量生产时。虽然许多这些产品属性的选择是常见且直接的，但有时，未权衡属性价值与成本敏感性的规格会产生意想不到的成本和相应的价格影响。
概括
集成到荧光成像和检测系统中的滤光片可以说是定义系统性能的最重要元素。新一代薄膜滤光片改善了透射、阻挡以及透射和反射波前特性。这转化为明亮、高对比度的图像和目标分子的准确检测。
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